蛋白质样品前处理,真的很重要!


蛋白质的分离、纯化对蛋白质结构功能研究具有重要意义,蛋白质分离技术是利用蛋白质的特性,如,溶解度、分子质量大小、等电点、吸附特性和其它离子的生物亲和力等的不同,选择合适的分离模式并建立最佳的纯化方法。常用的分离方法包括沉淀法、色谱法和电泳及毛细管电泳。


几种方法供你选择!


(1)沉淀法

利用蛋白质在溶液中的不同溶解度。蛋白质的溶解度取决于分子中氨基酸的类型和电荷数,通过改变缓冲液pH值、离子强度、介电常数或温度而改变蛋白质的溶解度。主要使用的沉淀分离技术有盐析、等电点沉淀、溶剂分级分离。


(2)透析法

利用半透膜只允许小分子透过而大分子不能透过的原理来分离溶液中的蛋白质。通常至少需要12h。


(3)超滤法

采用半透膜在一定压力下,按照分子质量大小分离溶质的一门技术。与透析相似,但速度快得多。


蛋白质的构成成分:氨基酸前处理

1.氨基酸的分离和检测手段,以往用化学分析法、层析法、比色法、气相色谱法、氨基酸自动分析仪。


2.随着高效液相色谱及填料的发展,HPLC在氨基酸检测方面显示了其特有的优越性,但大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性,为提高分析检测灵敏度和分离选择特性,通常将氨基酸衍生,衍生方式有柱前衍生法与柱后衍生法。


3.HPLC与各种衍生相结合的氨基酸分析技术,构成了具有广泛适用性的现代氨基酸分析技术。


样品处理

测定蛋白质中的总氨基酸,必须先把蛋白质水解成游离氨基酸。可采用酸水解、碱水解和酶水解方法,其中以酸水解法应用最广泛。


(1)酸水解

条件:

常用硫酸或盐酸进行水解。一般用6mol/LHCl,4mol/L H2SO4煮沸回流24小时左右。

优点:

可蒸发除去盐酸,水解彻底,终产物为L-α-氨基酸,产物单一,无消旋现象。

缺点:

色氨酸破坏,丝氨酸和苏氨酸有一小部分被水解,同时天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。


(2)碱水解

条件:

分析色氨酸可采用碱水解法,一般与5mol/L NaOH煮沸10~20小时。

优点:

水解彻底,色氨酸不被破坏,水解液清亮。

缺点:

产生消旋产物,破坏的氨基酸多。

  

(3)酶水解

某些氨基酸对酸或碱不稳定,在酸或碱水解时易被破坏,某些蛋白质样品在酸或碱水解不完全,影响某些氨基酸的回收率。对这些样品可采用酶水解法。酶水解法可定量测定天东氨酸、谷氨酸和色氨酸。

条件:

蛋白酶,如,胰蛋白酶、糜蛋白酶,常温37~40℃, pH值5~8 。

优点:

氨基酸不被破坏,不发生消旋现象。

缺点:

水解不完全,中间产物多。


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